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    T、B淋巴細(xì)胞分離

    發(fā)布時間： 2022-03-11　　點擊次數(shù)： 1094次

    原理

    淋巴細(xì)胞與用溴花二氨基異硫氫化物（簡稱AET）處理的綿羊紅細(xì)胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴細(xì)胞均能吸附AET-SRBC，形成牢固穩(wěn)定而巨大的E-花環(huán)，較正常未處理的SRBC形成的E-花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離時，AET-E花環(huán)易沉于管底，而未形成E-花環(huán)的T淋巴細(xì)胞，用低滲液解花環(huán)周圍的 AET-SRBC，便可獲得純T淋巴細(xì)胞，而B淋巴細(xì)胞可直接取自分層液的界面。

    材料與儀器

    新鮮豚鼠血
    Hanks液 小牛血清 199培養(yǎng)液 生理鹽水 氯化鈉溶液
    離心管 離心機(jī)

    步驟

    1.  AET-RRBC制備


    （1）AET溶液的制備
    稱取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸餾水中，使成為0.143 M 溶液，用4N NaOH溶液調(diào)pH9.0。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。

    （2） AET處理RRBC
    取洗滌好壓積的RRBC，按一份壓積AET—RRBC加入4份新鮮配制的pH9.0的AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次。取出加冷無菌生理鹽水至離心管口（1~2厘米）1800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。連續(xù)洗滌3-5次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少AET-RRBC粘附成團(tuán)，并觀察有無溶血。若有溶血現(xiàn)象，則用含小牛血清的199培養(yǎng)基再洗一次，最后配成10%AET-RRBC懸液，置4℃保存，不得超過5天。

    （3）1%AET-RRBC的配制：
    將預(yù)先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET-RRBC，以含10%小牛血清的199培養(yǎng)液稀釋至1%。

    2.  從新鮮豚鼠血液分離單個核細(xì)胞，操作見后試驗。

    3.  AET—E花環(huán)試驗：
    將分離的單個核細(xì)胞（2x106/毫升）與等量1%AET-RRBC混合，置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數(shù)管，每管2—3毫升，低速離心（1000轉(zhuǎn)/分鐘）5分鐘后，移至4℃冰箱45分鐘。

    4.  T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分離
    將形成E-花環(huán)的細(xì)胞懸液，再用淋巴細(xì)胞分層液分離，吸取界面云霧狀的細(xì)胞，即為富含B淋巴細(xì)胞群。沉淀于管底的E-花環(huán)，用Hanks液洗一次后，加雙蒸水3毫升處理3分鐘，低滲裂解E-花環(huán)周圍的RRBC，立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含T淋巴細(xì)胞群。


    注意事項


    1. 分離B細(xì)胞過程較長，為了避免B細(xì)胞自然死亡，在最后沖洗B細(xì)胞時可以用1640,而且要加入5一10%的小牛血清。


    2. 每次洗滌時，不要將試管底部液體吸干，即防止壓積的B細(xì)胞接觸空氣。


    3. 使用抗B淋巴細(xì)胞血清與受檢細(xì)胞按NIH方法進(jìn)行微量B細(xì)胞毒試驗，使用倒置相差顯微鏡讀數(shù)。


    常見問題


    關(guān)于從小鼠脾臟中分離：


    1.脾臟組織所含結(jié)締組織比較少，可以直接在篩網(wǎng)上研磨，無需剪碎，也不用顧慮血管。


    2.ficoll中含多聚糖，所以許多人喜歡把它放4度存放，是否室溫對實驗影響不大脾臟分離淋巴細(xì)胞實驗比較簡單，所以用普通的淋巴細(xì)胞分離液就行。


    3 .離心2000rpm×20min，這步很關(guān)鍵，還有就是加細(xì)胞懸液時一定要貼壁緩慢加入，不要破壞分界面，分離液與細(xì)胞懸液我常用1：2，還有就是所選用的離心管粗細(xì)也會影響分層。


    4.中間的懸浮白色環(huán)狀細(xì)胞層即是所要的淋巴細(xì)胞層。


    5.洗細(xì)胞主要是洗去分離液，所以不能省去。


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