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    假陽性?條帶不對?菌液PCR問題一網(wǎng)打盡

    發(fā)布時間: 2024-06-13  點擊次數(shù): 586次

    1.平板長菌,但挑的單克隆菌落搖不起來?

    產(chǎn)生原因及解決辦法:

    (1)挑取的單克隆為雜菌,呈假陽性。出現(xiàn)這種情況的原因包括:①配制平板過程中,加入抗生素時溫度過高致使抗生素滅活;②配制平板過程中,抗生素濃度過低;③平板培養(yǎng)時間太長導(dǎo)致抗生素失效。


    (2)液體培養(yǎng)基的抗生素使用錯誤。


    (3)液體培養(yǎng)基抗生素濃度過高,導(dǎo)致大腸桿菌生長緩慢。


    (4)菌液保存太久,導(dǎo)致菌的活力過低。辦法:重新劃線涂板,挑取單克隆。


    (5)自己制備的感受態(tài)細(xì)胞受到雜菌污染。


    (6)噬菌體污染?,F(xiàn)象描述:菌液清亮或渾濁后變?yōu)榍辶粒撞坑谐恋?。辦法:甲醛熏蒸超凈臺,對整個實驗環(huán)境進(jìn)行消毒;重新提質(zhì)粒,重新轉(zhuǎn)化。


    2. 平板長菌,挑的單克隆菌落能搖起來,但菌液PCR沒有條帶?

    產(chǎn)生原因及解決辦法:

    (1)重組或連接失敗。出現(xiàn)這種情況的原因包括:①質(zhì)粒沒有切開;②質(zhì)粒切開后自連。

    (2)搖菌時間過長,菌液濃度過大。辦法:搖菌不超過6小時,4-5小時即可。

    (3)PCR反應(yīng)體的原因。出現(xiàn)這種情況的原因包括:①酶;②引物。辦法: 換酶,使用熱啟動酶;使用載體通用引物。

    3. 平板長菌,挑的單克隆菌落能搖起來,但菌液PCR與陽性對照的大小不對?

    產(chǎn)生原因及解決辦法:

    (1)引物特異性差,導(dǎo)致擴(kuò)增到大腸桿菌的基因。辦法:使用載體的通用引物。

    (2)目的基因存在所用酶的酶切位點,酶切位點切錯,僅部分連接,導(dǎo)致片段變小。

    (3)小片段核酸污染。這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補后擴(kuò)增出條帶。

    (4)瓊脂糖凝膠電泳會產(chǎn)生偏差,相差一點極有可能是目的條帶。辦法:送測序進(jìn)行驗證。

    4. 平板長菌,挑的單克隆菌落能搖起來,但菌液PCR出現(xiàn)多條條帶?

    產(chǎn)生原因及解決辦法:

    (1)引物特異性差,導(dǎo)致擴(kuò)增到大腸桿菌的基因。辦法:使用載體的通用引物。

    (2)Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,PCR循環(huán)次數(shù)過多。

    (3)酶量過多或酶的質(zhì)量差。

    (4)菌落污染。

    5. 平板長菌,挑的單克隆菌落能搖起來,菌液PCR也有目的條帶,但測序無信號?

    產(chǎn)生原因及解決辦法:

    (1)未連接到載體的目的片段仍存在在菌液里,單克隆的菌落為原始質(zhì)粒,菌液PCR有條帶。

    (2)污染。出現(xiàn)這種情況的原因包括:①菌液污染。②酶,引物,Buffer等污染。③氣溶膠污染。

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