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    TRIzol提取細(xì)胞RNA的經(jīng)驗分享

    發(fā)布時間： 2024-03-26　　點擊次數(shù)： 534次

    一、TRIzol法提取RNA的原理

    Trizol是一種廣泛適用于多種樣品總RNA提取的試劑，例如人、動物、植物和細(xì)菌、血液等。一般提取的總RNA沒有DNA和蛋白質(zhì)污染，常用于RT-qPCR、mRNA純化等實驗。


    廣譜型Trizol含有異硫氰酸胍/酚，具有裂解能力，可在短時間內(nèi)裂解細(xì)胞和組織樣本并有效抑制RNase酶活性從而保證RNA的完整性。其原理是Trizol中異硫氰酸胍、苯酚等不可逆地使蛋白質(zhì)和RNase變性。隨后進(jìn)行離心。在酸性條件下，總RNA保留在上層水相中，而大部分DNA和蛋白質(zhì)保留在中間相或下層有機(jī)相中。然后通過用異丙醇沉淀回收總RNA。


    在這個過程中，可利用吡咯碳酸二乙酯(DEPC)可滅活RNase酶，75%的酒精洗滌RNA沉淀，去除蛋白質(zhì)，相關(guān)有機(jī)物的污染；最后用無核酶水溶解白色沉淀得到所需RNA。值得注意的是TRizol有毒，需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，做好自我防護(hù)！！


    二、實驗步驟
    以細(xì)胞6孔板為例：

    通常情況下，6孔板一般種100萬/孔細(xì)胞左右，對于TRIZOL法而言，該細(xì)胞數(shù)目已經(jīng)足夠，但對于新手而言，該數(shù)目提取的RNA濃度可能較低，因此我一般做濃度梯度或者時間梯度實為了保證RNA足夠后續(xù)實驗要求，因此我會再6孔板里面鋪200萬/孔細(xì)胞或者用6cm的中皿鋪300萬細(xì)胞。
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    圖1. 六孔板(孔內(nèi)細(xì)胞經(jīng)過處理，渾濁程度不同)
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    圖2. 6cm培養(yǎng)皿

    （1）對于細(xì)胞鋪板：一般情況下我會收集10cm的皿4個或者5個T25培養(yǎng)瓶，一般情況下細(xì)胞生長較好可能會有3000-4000萬的細(xì)胞，多的有5000萬（懸浮細(xì)胞）。以懸浮細(xì)胞為例，漿細(xì)胞收集至15ml離心管后，離心去上清，再用1-2ml新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，通常會用1ml重懸。根據(jù)傳統(tǒng)的細(xì)胞計數(shù)板估計細(xì)胞數(shù)目：


    ①將計數(shù)板和蓋玻片擦干凈，通常用酒精噴洗幾次，將蓋玻片蓋在計數(shù)板上

    ②此時我們會對細(xì)胞重懸液進(jìn)行稀釋，一般稀釋10-20倍（20ul細(xì)胞懸液+180細(xì)胞培養(yǎng)基/20ul+380ul）

    ③計數(shù)板四個大方格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞計左不計右，按照公式：細(xì)胞數(shù)/ml：4個大格子細(xì)胞總數(shù)/4 ×稀釋倍數(shù)
    例如：細(xì)胞重懸為2ml，稀釋20倍，鋪6孔板，每孔大約200萬個細(xì)胞則：四個大方格計數(shù)分別為36,38,39,48，則平均數(shù)為40.25，細(xì)胞數(shù)目為40.25×20×10^4即大約有805萬個細(xì)胞/ml。
    鋪6孔板大約需要1200萬個細(xì)胞/2ml，則將取樣誤差計算在內(nèi)：1200/805≈1.5，最終取1.51ml=1510ul細(xì)胞加新鮮培養(yǎng)基至12.1ml，驗證：(1.51×805)/12.1≈100萬細(xì)胞左右，每孔取2ml。

    （2）言歸正傳，目前使用RNA裂解液（TRIZOL）提取RNA：需要自備無核酶水（DEPC水），異丙醇，氯仿（目前一般用氯仿替代物），無水乙醇。主要注意事項是：保證無酶環(huán)境，在通風(fēng)櫥內(nèi)操作！
    1）貼壁細(xì)胞：先用PBS清洗細(xì)胞1~2次，六孔板對照組和實驗組內(nèi)各加1mlRNA裂解液或0.5ml覆蓋細(xì)胞，吹打細(xì)胞使其裂解，并將細(xì)胞+RNA提取液轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中（無酶），做好標(biāo)記，室溫靜置5min左右；

    2) 向上述裂解液中加入1/5RNA裂解液體積的氯仿200ul(1ml)/100ul(0.5ml)，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15s左右，使兩者充分混合，呈現(xiàn)乳濁狀（RNA裂解呈粉紅色），室溫靜置5min。
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    3）12000×g 4℃離心15min，樣品分層：上層無色液體，中間層乳白絮狀沉淀（盡量不要吸取到，可能會導(dǎo)致基因組DNA的污染），下層粉紅色有機(jī)相，小心吸取上層無色液體至新的無酶EP管中，通常情況下，取小于RNA裂解液體積的60%約為500ul/200ul。
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    4）在新的EP管中加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置10min；
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    5）2000×g 4℃離心10min，去上清，出現(xiàn)白色膠狀沉淀即RNA；

    6）現(xiàn)配現(xiàn)用75%的乙醇（15ml離心管：11.25ml無水乙醇+3.75mlDEPC水/無RNase-free水），加入1.5ml離心管中，輕輕將沉淀彈起洗滌沉淀，7500g× 4℃。一般洗兩次。

    7）室溫晾干5min左右，一般沒有被揮發(fā)的液體為無核酶水。最后加入30-50ul（一般加入30ul），溶解沉淀。放置-80保存以供后續(xù)使用。
    三、注意事項
    1、上述步驟為常規(guī)提取RNA的步驟，前提是我們的細(xì)胞量足夠，否則整個過程可能就非?？简灐靶拍罡?（很可能在異丙醇沉淀RNA這一步驟未有白色沉淀出現(xiàn)）：

    （1）做過：6孔板每孔鋪100萬細(xì)胞，3孔并提最終RNA濃度可達(dá)1000多ng/ul，目前200萬每孔RNA濃度穩(wěn)定在300-500ng/ul(六孔板細(xì)胞鋪板數(shù)目有限)；

    （2）步驟3）中吸取水相時，盡可能大小移液槍交替使用，例如取500ul，可使用200ul、100ul、50ul等體積多次吸取，盡量不要吸取到中間的絮狀沉淀。

    2、異丙醇沉淀RNA這一步很關(guān)鍵，在我們離心后吸取丟棄上清時，在這一步之前我們有必要記住離心管放置的位置，例如離心管蓋子方向統(tǒng)一朝外，根據(jù)離心方向，我們可以有選擇吸棄上清，如下圖所示。
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    圖3. 離心管擺放位置
    3、值得注意的是75%的酒精現(xiàn)配現(xiàn)用，濃度過低洗滌不佳，還會導(dǎo)致RNA溶解，事實上第二次洗滌沉淀時我們也可以使用100%酒精，離心轉(zhuǎn)速7500×g或不更換轉(zhuǎn)速12000×g也可，洗滌次數(shù)不能偷懶，洗滌不干凈可能會造成后期RNA濃度測定時蛋白質(zhì)污染。

    4、室溫晾干RNA沉淀時，可以倒扣離心管在濾紙上或者放在通風(fēng)櫥內(nèi)，放置時間不宜過長，時間過長會導(dǎo)致RNA不易溶解。

    5、最后，在異丙醇沉淀RNA這一步驟中，如果看不見沉淀或者看不清沉淀，一種方法是我們可以使用手機(jī)手電筒或者mini小手電照射離心管管壁，可能會有微小的白色附著物，或者如第3點中所說的記住離心管的擺放位置，大小移液槍更換小心吸棄異丙醇。之后按步驟來可能仍會提出RNA。

    6、另外，TRIZOL法提取RNA可將細(xì)胞收集至離心管中即步驟（1）完成后，可將含細(xì)胞的RNA裂解液于-80冰箱保存保存月余。

    7、通常為了節(jié)約試劑，減少用量，0.5ml的TRIZOL足夠RNA的提取。


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