養(yǎng)過細(xì)胞的小伙伴們肯定都知道，細(xì)胞養(yǎng)得好不好就看細(xì)胞傳代是的操作手法好不好了。因為懸浮細(xì)胞是可以不用消化直接離心收集沉淀就好，基本沒有操作難度。所以今天我們主要來聊一聊貼壁生長的細(xì)胞的傳代操作方法。

      貼壁生長的細(xì)胞當(dāng)在培養(yǎng)瓶內(nèi)長成致密的單層后，由于繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多，同時代謝廢物也會增多時，即細(xì)胞密度長到80%-90%時，則說明需要對細(xì)胞進行傳代操作來分瓶培養(yǎng)或者凍存處理。

      實驗室時內(nèi)最-常用的傳代方法是胰酶消化法。一般細(xì)胞系和較常見的原代細(xì)胞都可以使用胰酶消化法來進行細(xì)胞的消化處理。不過，這種方法對操作者的手法要求較高，畢竟如果消化不足吧，細(xì)胞下不來，或者細(xì)胞還是聚團狀的；消化過頭了吧，對于細(xì)胞的損傷較大，不利于細(xì)胞的長期培養(yǎng)。那么，今天我們就來聊聊關(guān)于胰酶消化的那些事吧。

      首先，小伙伴們要做好實驗前的準(zhǔn)備工作哦，要知道消化時間就那么幾分鐘，如果準(zhǔn)備不充足，可能消化時會手忙腳亂嚴(yán)重的更是導(dǎo)致細(xì)胞消化過度呢。所以，我們來看看有哪些實驗前的準(zhǔn)備工作要做吧。

      為了不刺激細(xì)胞，同時使胰酶的消化效率-最高，我們需要將消化時要用到的試劑，比如胰酶，終止液，培養(yǎng)基等，提前放入37℃水浴鍋內(nèi)進行預(yù)熱處理呢。

小伙伴們一定要加強自己的無菌意識。良好的無菌意識是細(xì)胞實驗成功的前提，所以我們要提前做好消毒措施。實驗前打開超凈工作臺的紫外燈開關(guān)，紫外消毒至少半小時。工作臺消好毒后，用75%酒精擦拭工作臺表面，點燃酒精燈，（注意酒精燈的火焰不能太小也不能太大，安全也很重要，不要燒到手），然后將預(yù)熱好的試劑（用75%的酒精擦拭試劑的表面，擦干，小心瓶口過火的時候未擦干的酒精燃燒）放入工作臺，同時準(zhǔn)備好需要的一次性滴管，離心管之類的耗材。正確擺放需使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染的概率。

      提前在離心管上寫好細(xì)胞的名稱并將胰酶中止液加入到離心管中，保證中止液的量是所加的胰酶的量的2-3倍。否則可能導(dǎo)致中止不完-全，細(xì)胞消化過度。

      準(zhǔn)備工作做好了，就要開始進行細(xì)胞的消化了。消化的過程要做到忙而不亂，有序進行操作。由于一般的消化時間也就只有2-5分鐘左右，所以操作時不能太慢，比如已經(jīng)看見細(xì)胞消化完-全了，結(jié)果操作時加入中止液用了30秒，那這樣的話則完-全無法避免細(xì)胞消化過度這種事情的發(fā)生了。當(dāng)然，因為著急怕細(xì)胞消化過度而導(dǎo)致忽略了無菌操作也是不可取的。

      消化之前用PBS洗滌一到兩遍，是常見的操作，因為培養(yǎng)基中的血清含有抑制胰酶的蛋白。小心吸出舊培養(yǎng)基，用PBS清洗（沖洗），然后加入適量消化液（胰蛋白酶液），一般來說，細(xì)胞系的消化用0.25%的胰酶，而原代細(xì)胞的消化則需要用更溫和的0.05%的胰酶。注意消化液的量以蓋住細(xì)胞表面最好，一般T25瓶中加入1ml左右，T75瓶中加入3ml左右即可，最佳消化溫度是37℃。將加好胰酶的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中消化，記錄好消化時間。

      胰酶消化的程度是一個關(guān)鍵：消化過度則對細(xì)胞的活性損傷較大，并有部分細(xì)胞漂?。幌蛔銊t細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會損傷細(xì)胞活性。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時間及溫度等）、消化時的溫度（氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等。

      而且細(xì)胞的消化時間是沒有一個準(zhǔn)確的數(shù)值定論的，同一個細(xì)胞同一個人操作，第一次和第二次的消化時間也不盡相同，畢竟人操作的如擰緊瓶蓋，走路從工作臺到培養(yǎng)箱的時間等不可控的因素太多了。所以我們只能記錄一個大概的時間范圍，那么，下次再次消化這種細(xì)胞時可提前設(shè)定好時間，提前將消化的細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱防止消化過度。

      一般書上都說要在顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時細(xì)胞消化適度。實際上當(dāng)我們真的這樣操作時，可能細(xì)胞都有一點點消化過度。不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動了，多半呈流沙狀移動時，其實細(xì)胞的消化已經(jīng)可以了。很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打成完-全分離細(xì)胞，這是沒有必要的。一般細(xì)胞呈流沙狀移動了，說明細(xì)胞與培養(yǎng)瓶的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，說明細(xì)胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個時候就應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止，這樣會導(dǎo)致細(xì)胞消化過度。細(xì)胞就是完-全成單個細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個特性，無論死的活的細(xì)胞都是如此。小伙伴們?nèi)绻恍牛梢栽谄綍r消化細(xì)胞的時候觀察觀察，也可以嘗試一下，準(zhǔn)備100%的單個細(xì)胞懸液，貼壁后觀察細(xì)胞，仍然是幾個幾個細(xì)胞聚集在一起。一些懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也是如此，容易聚集生長，所以不要去嘗試過幾個小時就把細(xì)胞拿出來吹打幾下，直到細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液（看到這里，有些小伙伴可能覺得很好笑，但是這個是初養(yǎng)懸浮細(xì)胞的小伙伴們經(jīng)常犯的錯誤，以為懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞就是一個一個分開的）。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，即使這個時候是成片的（比如Calu-3細(xì)胞），吹打不超過20次后（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細(xì)胞左右），是正常的，不要試圖再去延長消化時間，或者像有的同學(xué)那樣吹打1h，等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)，這樣會導(dǎo)致細(xì)胞消化過度，細(xì)胞裂解甚至死亡。    觀察到細(xì)胞脫落，那么就只剩下最后一步，細(xì)胞的消化就基本完成了。將消化好的細(xì)胞懸液加入到含中止液的離心管中，并用中止液潤培養(yǎng)瓶，中止細(xì)胞消化。同時，用滴管輕輕將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，收集細(xì)胞沉淀，那么，細(xì)胞消化的過程就已經(jīng)完成，小伙伴們可以繼續(xù)接下來的傳代或者凍存的操作了。

      事實上，除了常見的胰酶消化外，也有許多小伙伴不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA聯(lián)合作用的方式來進行消化。但是，小伙伴們，你們要明白，胰酶的作用是切斷細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)之間的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA則是通過螯合Ca離子，從而作用于Integrin的活性，來使細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)分離。所以綜合而言，EDTA的作用更加溫和。當(dāng)然也有一些人在胰酶里添加一些EDTA，或者在對付特別難消化的細(xì)胞，添加多一些EDTA，也是同樣的道理。注意EDTA是不能被血清中和的，使用EDTA消化細(xì)胞后原先的培養(yǎng)瓶要徹-底清洗，否則再培養(yǎng)時細(xì)胞容易貼壁不牢。

      在遇到特別難消化的細(xì)胞，小伙伴們不要試圖通過延長消化時間（如果10min還消化不徹-底的話）的方法來使消化完-全，而應(yīng)該想想其它辦法。消化比較難消化的細(xì)胞時，注意需要用不含Ca，Mg離子的DPBS來進行潤洗，因為這些離子也會抑制胰酶的活性。同時一般可以先用少量胰酶進行孵育再來進行消化，但也不需要加入很多胰酶，一般來說100 mm皿，一次最多加入500ul胰酶來孵育就已經(jīng)足夠了。通常來說，對于難消化的細(xì)胞，使用這樣的消化手法，一般不超過5min，就可以看見細(xì)胞成流沙狀移動，這時即應(yīng)該停止消化。

      當(dāng)然，當(dāng)在顯微鏡下看見貼壁的細(xì)胞成片或者聚團生長時，不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好，消化的時候沒有消化完-全，這個要視細(xì)胞而定。如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致，那有可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確，也觀察到細(xì)胞消化完-全了，卻仍然成片分布，甚至完-全吹打成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞在貼壁后仍然成片分布，那么可以肯定這是細(xì)胞的特性，是因為貼壁過程中重新聚集了。這個時候你拼了命要去讓它均勻分布，你的細(xì)胞之后會越來越不好，甚至導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

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