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    單層細(xì)胞的傳代

    發(fā)布時(shí)間： 2022-12-05　　點(diǎn)擊次數(shù)： 751次

    原理

    去除培養(yǎng)基，加人胰蛋白酶短暫作用，孵育，以培養(yǎng)基分散細(xì)胞，計(jì)數(shù)，稀釋并再接種。

    材料與儀器

    A549細(xì)胞 WI-38 MRC-5 胰蛋白酶 D-PBS
    70%乙醇噴壺
    生長(zhǎng)培養(yǎng)基 吸管 離心管 培養(yǎng)瓶 移液器 吸耳球 吸水紙巾 吸管桶 抗乙醇記號(hào)筆 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

    步驟

    1. 準(zhǔn)備超凈工作臺(tái)，將試劑及材料置于超凈臺(tái)，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

    2. 仔細(xì)檢査培養(yǎng)物有無(wú)污染或衰退跡象。

    3. 依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和你對(duì)該培養(yǎng)物行為的了解，決定是否需要傳代（做練習(xí) 13者應(yīng)記錄細(xì)胞密度和狀態(tài)，如有絲分裂、多層、細(xì)胞變性）。若需要傳代，如下進(jìn)行。

    4. 將培養(yǎng)物置于無(wú)菌工作區(qū)域，除棄舊培養(yǎng)基。各種細(xì)胞（A 549細(xì)胞，以 2×104 /ml 接種在 25 cm2 培養(yǎng)瓶中7 天和14天；WI-38，MRC-5，或同樣正常二倍體成纖維細(xì)胞，以 2×104 /ml 接種在 25 cm2 培養(yǎng)瓶中7 天和14天）分開(kāi)進(jìn)行，每種細(xì)胞均重復(fù)從此以下步驟。

    5. 為避免沖散細(xì)胞，沿培養(yǎng)瓶細(xì)胞面對(duì)側(cè)加人 D-PBS/EDTA  ( 0.2 ml/cm2）（D-PBS 含 1 mmol/L EDTA），清洗細(xì)胞，去除預(yù)洗液。這一步驟的目的在于去除殘留血清，因?yàn)檠蹇梢种埔鹊鞍酌傅淖饔?，去除?xì)胞黏附所需的二價(jià)陽(yáng)離子。

    6. 沿培養(yǎng)瓶細(xì)胞對(duì)側(cè)面加入胰蛋白酶（0.1 ml/cm2 )（0.25 % ，D-PBS 配置）。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶平放。確保胰蛋白酶全部覆蓋細(xì)胞層。靜置 15~30 s。

    7. 立起培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶離開(kāi)細(xì)胞層，快速檢査單層細(xì)胞是否尚未脫落。如果細(xì)胞未解離即脫壁就成問(wèn)題，使用 4°C 胰蛋白酶可以防止該問(wèn)題發(fā)生。

    8. 吸走大部分胰蛋白酶，只留數(shù)滴。

    9. 平置培養(yǎng)瓶孵育，直至細(xì)胞變圓隆起，傾斜培養(yǎng)瓶，單層細(xì)胞就會(huì)從培養(yǎng)瓶表面滑落（通常發(fā)生在 5~15 min 以后）。注意不要消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，另一方面也不要在細(xì)胞消化好前強(qiáng)制將細(xì)胞吹打下來(lái)，這樣將導(dǎo)致細(xì)胞成片脫落。

    10. 加人培養(yǎng)液（0.1~0.2 ml/cm2 )，反復(fù)以吸管（吸管，帶刻度、塞棉花。如果是玻璃的，根據(jù)大小置于方細(xì)胞盒中，如果是塑料的，單個(gè)包裝，分類(lèi)放在架子上，用于吸除培養(yǎng)液的未塞棉花吸管，如果有泵和真空吸引管道的話(huà)）吹打單層培養(yǎng)細(xì)胞面以分散細(xì)胞。

    11. 最后，將吸管的尖（立耑）放于培養(yǎng)瓶底角，上下吹打細(xì)胞幾次，注意不要產(chǎn)生氣泡。吹打的強(qiáng)度各個(gè)細(xì)胞系有所不同，有的細(xì)胞系很容易分散，而有的則需大力吹打才能分散。但若吹打力量過(guò)大幾乎所有的細(xì)胞都會(huì)受到剪切力的機(jī)械損傷。原代或早期幾代培養(yǎng)的細(xì)胞由于它們較脆弱和體積較大而尤其容易受到損傷，而連續(xù)細(xì)胞系通常有較大彈性，需要大力吹打才能全部解離。充分上下吹打以分散細(xì)胞使之處于單細(xì)胞懸浮狀態(tài)。若這一步驟進(jìn)行困難，選用更強(qiáng)的解離試劑。
    傳代過(guò)程中單細(xì)胞懸液是較理想的，它有助于保證細(xì)胞的計(jì)數(shù)準(zhǔn)確和再接種后均一性生長(zhǎng)。若要進(jìn)行細(xì)胞增殖或貼瓶率的計(jì)數(shù)或進(jìn)行細(xì)胞克隆分離，制備單細(xì)胞懸液是必需的。

    12. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板或電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞并記錄數(shù)值。

    13. 稀釋?xiě)乙褐敝梁线m的接種濃度。

    (a) 加人適量細(xì)胞懸液到已有已知體積培養(yǎng)基（生長(zhǎng)培養(yǎng)基，如1× MEM 加 Earle 鹽、23 mmol/L NaHCO3，無(wú)抗生素）的培養(yǎng)瓶中，或

    (b) 稀釋細(xì)胞至所需的總體積，然后再分裝到各個(gè)培養(yǎng)瓶中。

    程序(a)適合常規(guī)傳代，傳瓶數(shù)不多且不需要準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)和增殖能力測(cè)定，但若同時(shí)做多個(gè)相同的培養(yǎng)，程序(b)則更適合。因?yàn)椴僮鞯拇螖?shù)減少，每一培養(yǎng)瓶中細(xì)胞密度全部一致。

    對(duì)于練習(xí)13 , 用(b)程序：用 20 ml 培養(yǎng)液稀釋各瓶的細(xì)胞至 2×104/ml, 從每瓶細(xì)胞懸液中取 5 ml, 接種到 2 個(gè)培養(yǎng)瓶中。

    14. 如果細(xì)胞在提高 CO2 的情況下（如材料中所列的 Eagle MEM 含 Earle’s 鹽和 23 mmol/L NaHCO3）生長(zhǎng)，則從提前混合好的混合氣體瓶或氣體混合裝置通過(guò)過(guò)濾管注人正確的氣體（此次是 5 % CO2）至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基上面供氣。注意不要將氣體吹入培養(yǎng)基內(nèi)，那樣會(huì)產(chǎn)生氣泡，氣泡可能使培養(yǎng)基的某些成分變質(zhì)，同時(shí)也會(huì)增加污染的兒率。如果正常氣相是空氣，用含 Hank 鹽的 Eagle MEM 培養(yǎng)基，這一步驟可以省略。

    15. 蓋上培養(yǎng)瓶，放回孵箱中，大約一小時(shí)后檢查 pH 的變化。若在空氣相中培養(yǎng)基 pH 升高，則要將培養(yǎng)瓶移至無(wú)菌區(qū)域內(nèi)，向其中快速（1~2 s ) 吹入 5 % CO2 。因?yàn)槊恳慌囵B(yǎng)物的行為在相同的培養(yǎng)基中是已知的，最終會(huì)清楚傳代時(shí)哪種細(xì)胞需要吹氣，而不必首先孵育觀察。如果在 5 % CO2 氣相中培養(yǎng)基的 pH 還是升高（如本實(shí)驗(yàn)），可以增加 CO2 濃度至 7 % 或 10 % 或者加人無(wú)菌的 0.1 mol/L 的 HCl。

    16. 從操作步驟 4 重復(fù)本程序，對(duì)第二個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行傳代。

    注意事項(xiàng)

    在每種情況下， 主要的解離試劑， 不論是胰蛋白酶或是 EDTA , 僅做短暫停留， 去除大部分消化液后， 僅留少量消化液進(jìn)行孵育。如果在分離細(xì)胞以及后續(xù)制備單細(xì)胞懸液過(guò)程中遇到困難， 可采用其他程序。

    常見(jiàn)問(wèn)題

    本程序第 15 步不可作為傳代后 pH 升高這一問(wèn)題的長(zhǎng)期解決辦法，若問(wèn)題持續(xù)存在，則在配置培養(yǎng)基時(shí)降低其 pH，同時(shí)檢查在孵箱中或充氣的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的 pH。


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