步驟

一、材料與設備

1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置。

2. 光化學反應裝置（360 nm 長波長）：建議采用 Rayons RPR-100 光化學反應裝置 ( The Southern New England Ultraviolet Company，Branford，USA )。其他紫外光源 ( 如 Stratalinker ) 也都可以使用。此外，長波長的手提紫外燈（如 Model UVGL-25， San Gabriel，CA，USA ) 也適用于交聯(lián)反應，但需要照射較長吋間。

3. Sep-pak C18 膠片，購自 Waters ( MiIford，MA，USA）公司。

4. 旋轉(zhuǎn)真空干燥儀。

5. Sigmacote ( 可購自 Sigma 公司，St. Louis，MO，USA；為 Sigma 公司的一種硅烷化試劑）。

6. 變性膠電泳緩沖液（TBE）：0.09% mol/L Tris-硼酸，0.002 mol/L EDTA。配制 5X TBE 儲存液：取 900 ml 雙蒸水溶解 54 g Tris 和 27.5 g 硼酸，加入 20 ml 的 0.5 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 定容 1L， 高壓滅菌后保存。

7. 非變性膠電泳緩沖液：含 0.1% Triton X-100 的 TBE 緩沖液。

8. 1X 結合緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，20 mmol/L KCl，0.1% Triton X-100。

9. 10X 水解緩沖液：等體積混合 0.5 mol/L Na2CO3 和 0.5 mol/L NaHCO3 ( pH 9.2 )。

10. Nase T1，RNase T1 緩沖液：16 mmol/L 檸檬酸鈉（pH 5.0 )，0.8 mmol/L EDTA，0.5 mg/mL tRNA，3.5 mol/L 尿素。

11. Nase B cereos，Nase B cereos 緩沖液：16 mmol/L 檸檬酸鈉（pH 5.0 )， 0.8 mmol/L EDTA，0.5 mg/ml tRNA。

12. 電泳上樣緩沖液：9 mol/L 尿素，1 mmol/L EDTA，0.1% 溴酚藍或 98% 甲酰胺。1 mmol/L EDTA，0.1% 溴酚藍；非變性電泳上樣緩沖液：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，20 mmol/L KCl，0.1% Triton X-100，40% ( m/V ) 甘油，0.1% 溴酚藍。

13. 40% (m/V) 丙烯酰胺儲存液：380 g 丙烯酰胺，20 g 甲叉雙丙烯酰胺，定容至 1 L，過濾后 4°C 保存。變性膠工作液中含 7 mol/L 尿素和 1X TBE；非變性膠工作液中含 0.1% Triton X-100 和 1X TBE。

14. RNA 洗脫緩沖液：TBE 緩沖液 ( pH 7.2 ) ( 以 0.1 mol/L HCl 調(diào) pH )。

15. 四甲基乙二胺（TEMED) 和過硫酸銨。

16. 補骨脂素修飾的多肽或蛋白分子，5' 或 3' 末端標記 32P 的 RNA。

17. AMV 反轉(zhuǎn)錄酶及反應緩沖液（購自 Promega 公司）。

18. 放射自顯影所需的 X 射線片，壓片盒及圖像處理儀器等。

19. 蛋白酶 K 及反應緩沖液：10 mmol/L Tris-HCI ( pH 7.8 )，5 mmol/L EDTA 和 0.5% SDS。

20. 8-羥基補骨脂素，1，3-二碘丙烷，碳酸鉀，丙酮，石油醚，乙酸乙酯，硫酸鈉，硅膠 ( 購自 Aldrich 公司 )。

21. 0.1 mol/L 磷酸鈉（pH 7.4 )。

22. 10% 三Fyi suan水溶液。

23. 二甲基甲酰胺。

二、操作方法

1. 同半胱氨酸反應的補骨脂素合成

即合成 1 號化合物：8-[ ( 3碘丙基-1 )氧 ]補骨脂素 [ 8-[ ( 3-iodopropyl-1) oxy] psor-alen ]。

(1) 在 100 ml 的腳底燒瓶內(nèi)將 8-羥基補骨脂素（0.176 g，1 mmol )，1，3 -二碘丙烷 ( 1.15 ml，2.96 g，10 mmol ) 和碳酸鉀（1.38 g，10 mmol ) 溶解于 15 ml 丙酮中。

(2) 混合物于室溫振搖 10 h，薄保層析法對反應進行檢測（展開劑：石油醚：乙酸乙酯，4：1 )。反應*時無起始物質(zhì)。

(3) 真空濃縮燥反應物。

(4) 30 ml 水溶解干燥產(chǎn)物，以 20 ml 乙酸乙酯萃取 3 次。

(5) 用 30 ml 水洗萃取產(chǎn)物，再用 10 ml 飽和氯化鈉洗 1 次萃取產(chǎn)物。

(6) 加入約 2 g 硫酸鈉，室溫放置 4~6 h。

(7) 以硅膠對反應產(chǎn)物進行層析，石油醚：乙酸乙酯（4 : 1 ) 洗脫產(chǎn)物。純化得到的 1 號化合物（0.31 g ，產(chǎn)率為 85% ) 為淡黃色固體。

2. 補骨脂素與蛋白結合

(1) 通過定點突變或固相合成多肽將活性半胱氨酸插入到蛋白的特定位置。

(2) 對蛋白進行純化和特性檢測之后將蛋白 (1 nmol ) 和前面制備的 1 號化合物 (10 nmol ) 一同溶解于 100 μl 二甲基甲酰胺。

(3) 加入 50 μl 0.1 mol/L，pH 7.4 的磷酸鈉緩沖液，調(diào) pH 至 7.0。

(4) 室溫放置 16 h。

(5) 在反應液中加入約 10 μl 10% 三Fyi suan水溶液調(diào)節(jié)溶液的 pH 至 4.0~5.0 之間。

(6) 用 0.5 ml 氯仿提取未反應的補骨脂素，重復 3 次。

(7) 用 0.2 ml 1% 三Fyi suan水溶液洗有機相 3 次，回收溶解的多肽。

(8) 合并水相，在旋轉(zhuǎn)真空濃縮儀中將總體積濃縮至約 200 μl。

(9) 通過 TIPLC ( 采用 Zorbax 300 SB-C8 column 或其他適用于所研究的蛋白的柱料）純化結合補骨脂素的蛋白。所得到的結合了補骨脂素的蛋白的產(chǎn)率通常為 80% 左右。

3. 光交聯(lián)

(1) 小量交聯(lián)反應

在進行交聯(lián)反應前先制備變性聚丙烯酰胺凝膠（含 1X TBE 和 7 mol/L 尿素）。

將制備好的凝膠以 30W 功率預電泳 3~4 h。

將末端標記了 32P 的 RNA 溶解于 20 μl 結合緩沖液中（終濃度約為 2.5 μmol/L )， 85℃ 加熱 3 min 使 RNA 變性，再讓其逐漸冷卻至室溫，使 RNA 再折疊。

取 2 μl RNA，2 μl 5X 結合緩沖液，1 μl 0.1 μg/μl 酵母 tRNA，1~5 μl 雙蒸水，再加入結合了補骨脂素的蛋白，終體積為 10 μl ( 加入的蛋白量可通過凝膠電泳分析，選取合適的 RNA/蛋白比率)。

將反應液混勻，冰浴 20 min；同時用 95% 乙醇擦洗一個干凈的小玻璃平板，用 Sigmacote 硅化，從而更好的回收交聯(lián)后的樣品，將平板罝于冰上。

將準備好的樣品轉(zhuǎn)移到平板上，紫外照射（360 nm）10 min 至 20 min ( 最佳照射時間需根據(jù)時間-效成曲線判定）。

將照射后的樣品轉(zhuǎn)移至一個新的小管內(nèi)，以 10 μl 上樣緩沖液沖洗平板上殘留的樣品斑點后也合并入小管內(nèi)。

再向經(jīng)照射的樣品中加入 10 μl 上樣緩沖液，再在所有的樣品中加入 1 μl 20 μg/μl 酵母 tRNA 競爭 RNA 蛋白的結合。

所有的樣品于 90°C 加熱 3 min，上樣電泳，以 30W 功率電泳 2~4 h，直至溴酚藍前沿距膠底部 5 cm 位置。

拆膠后用保鮮膜包裹，于 -80℃ 放射自顯影。

(2) 大量交聯(lián)的制備

確定 RNA 分子上的交聯(lián)位點時需要大量的交聯(lián)反應。前面提及的交聯(lián)反應可以擴大 100 倍甚至更大，而終體積卻可以縮小至原先的一半。在紫外照射交聯(lián)時，為保證交聯(lián)效率和便于操怍，點在平板上的樣品最好不要多于 20 μl。

電泳膠的制備同前所述，同樣需要預電泳。

在紫外照射后，用 1/10 體積 3 mol/L NaAc ( pH 5.2 ) 和 2.5 倍體積的無水乙醇于 -80℃ 放置 30 min 以沉淀 RNA 和 RNA 交聯(lián)物。

于 16000 g 離心 20 min 去上淸，用少量的 75% 乙醇洗沉淀，再次離心去上淸。真空抽干。

用上樣緩沖液重懸產(chǎn)物，加入酵母 tRNA，90℃ 加熱 3 min，上樣電泳，同時在旁邊上樣孔內(nèi)加入末端標記的 RNA 作為對照。

拆膠后用保鮮膜包裹，于室溫放射自顯影（時間較短）。

對照放射自顯影的結果切下 RNA 和交聯(lián)物，搗碎，用 RNA 洗脫緩沖液洗脫，乙醇沉淀冋收。

4. 確定交聯(lián)位點

可以通過對純化的 RNA 交聯(lián)物進行 RNase 不*消化和堿水解反應來確定 RNA 上的交聯(lián)位點。片段的大小可以通過與已知序列和長度的寡核苷酸（經(jīng) RNasc T1 和 RNase B. cereus 消化的 RNA ) 進行比較來確定。

對于大量的或結構不穩(wěn)足的且不適于堿水解的 RNA，可以通過對純化的 RNA 交聯(lián)物進行引物延伸分析來找到 RNA 上的精確的參與交聯(lián)的位點。以 RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 拷貝終止于 RNA 的修飾位點或交聯(lián)位點，通過與對照序列的比較就可以找到反轉(zhuǎn)錄的終止位點。

(1) 不*堿性水解反應確定 RNA 交聯(lián)位點

將 32P 標記的 RNA 分別加入兩個干凈的離心管內(nèi)，標號 No.one，No.2； 將 RNA-蛋白交聯(lián)物加入第三個離心管，標號 No.3。

在 No.noe 管中加入 1 μl 10X RNase 緩沖液，1 μl 0.1 U/μl 的 RNase T1 或 RNase B. cereus，加雙蒸水至 10 μl，55℃ 孵育 6~12 min 。此反應是水解反應的片段大小對照。

另兩管加入 1 μl 10X 水解緩沖液，再加雙蒸水至10 μl，85℃ 孵育 8 min 得到 RNA 的堿水解片段。

三管均加入了上樣緩沖液，置于冰上，于 95℃ 加熱 2 min，上樣，變性膠電泳（膠已經(jīng)以 30W 預電泳 4 h ) 至所有條帶得到充分分離。

放射自顯影。

(2) 反轉(zhuǎn)錄（引物延伸分析）法確定 RNA 交聯(lián)位點

此方法中通常的 RNA 或 RNA 蛋白交聯(lián)物的用量為 0.1~1 pmol （具體用量取決于 32P 標記的 DNA 引物的活性）。

用蛋白酶 K 消化 RNA-蛋白交聯(lián)物，生成的 RNA-蛋白交聯(lián)物中的多肽僅含存較少的氨基酸：用 50 μl 蛋白酶 K 反應緩沖液重懸從膠中純化得到的 RNA-蛋白交聯(lián)物，加入 1 μl 蛋白酶 K 儲存液（2.5 mg/ml )，于 37℃ 反應 30 min。

乙醇沉淀 RNA-蛋白交聯(lián)物（方法同前），變性膠電泳純化 RNA 產(chǎn)物（方法同前）。

在反應管中加入 4 pmol 未交聯(lián)的 RNA，4 pmol 32P 標記的 DNA 引物，2 μl 5X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液，雙蒸水補充體積至 10 μl。另一反應管內(nèi)加入消化后的 RNA-蛋白交聯(lián)物，1 pmol 32P 標記的 DNA 引物，0.5 μl 5X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液，雙蒸水補充體積至 2.5 μl。75°C 退火 3 min，漸冷卻至室溫，離心收集產(chǎn)物。

分別以 G、A、C、U 和 X 標記五個反應管，均加 3 μl 核苷酸混合物，1 μl 5X 反轉(zhuǎn)錄緩沖液，在 G、A、C、U 各管中加入 2.5 μl 步驟(3)中未交聯(lián)的 RNA 混合液，將步驟(3)中 RNA-蛋白交聯(lián)物的混合液加入反應管 X。

在每個反應管中加入 1 μl ( 5 U/μl ) AMV反轉(zhuǎn)錄酶，起始延伸反應。

室溫溫育 10 min，于 42℃ 溫育 50 min。

向每個反應管中加入 12 μl 上樣緩沖液終止反應，95℃ 加熱 5 min，進行變性膠電泳。

放射自顯影。