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    變性凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

    發(fā)布時(shí)間： 2021-12-14　　點(diǎn)擊次數(shù)： 977次

    材料與儀器


    DNA
    乙醇 異丙醇 二甲基二氯硅烷 TEMED 變性丙烯酰胺溶液 SDS
    電泳儀 注射器 巴斯德吸管 干膠機(jī)


    步驟


    1.  制作每塊凝膠時(shí)，首先要用肥皂及水小心嚴(yán)格地清洗兩塊30 cm×40 cm的前后玻璃平板，用去離子水沖洗后晾干，用噴射洗瓶噴10%乙酵或異丙醇使平板濕海。

    2.  然后用Kimwipe紙或其他無(wú)絨紙巾將平板擦干。

    3.  戴手套在通風(fēng)櫥工作，用浸濕了含5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液的Kimwipe紙?jiān)诿科桨宓钠渲幸幻婕右粚哟巳芤?，并小心洗擦拭整面平板?br style="border: 0px solid; box-sizing: border-box; --tw-shadow:0 0 #0000; max-width: 100%; background-image: none !important; background-position: initial !important; background-size: initial !important; background-repeat: initial !important; background-attachment: initial !important; background-origin: initial !important; background-clip: initial !important; font-size: 0.32rem !important; line-height: 0.5rem !important; margin: 0px !important;"/>
    4.  待硅化層干后，用Kimwipe紙以70%乙醇或異丙醇擦凈并干燥，最后再檢查平板有沒(méi)有灰塵或其他物質(zhì)。

     
    5.  按廠商指南用0.2~0.4 mm 均厚的墊片和大的書(shū)本裝訂夾子組裝凝膠膠模夾層，注意墊片與平板的邊、底壓緊對(duì)齊。

    6.  制作每塊凝膠時(shí)，在100 ml 燒杯配制60 ml 所需的變性丙烯酰胺凝膠溶液，在灌膠（步驟7）前，*混勻60 μl TEMED和0.6 ml 10%過(guò)硫酸銨于每份丙烯酰胺溶液中。
     
    7.  立即灌膠，用60 ml 注射器小心吸出丙烯酰胺溶液，避免吸入氣泡，讓短平板朝上， 并使凝膠平板夾層與臬面成45度角，沿著平板的一邊慢慢將丙烯酰胺溶液推入兩片平板之間，其間可調(diào)整角度讓膠液慢饅流入夾層的一邊。

    8.  當(dāng)溶液達(dá)到短平板的頂部時(shí)，放下膠模夾層至其頂部邊緣離操作臺(tái)平面仍有5 cm 左右，其下墊一空的吸頭盒或其他物件以使之保持較低的角度。

    9.  將0.2~0.4 mm 厚的鯊魚(yú)齒樣品梳的平齊一側(cè)插入膠液中，至短平板下約2~3 mm，操作須十分小心以避免產(chǎn)生氣泡，用一個(gè)書(shū)本裝訂夾將平極之間的樣品梳夾緊，以避免在掩子與平板間形 成凝膠固塊。

    10.  加一層過(guò)量的丙烯酰胺溶液至梳子，保證其被*覆蓋。用水沖洗注射器，除去過(guò)量的丙烯酰胺。

    11.  除去每片膠模夾層的底部墊片或膠帶，用刀片除去樣品瓶周?chē)倪^(guò)量聚丙烯酰胺凝膠。

    12.  用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯酰胺溶液，從每片膠模夾層中撥去鯊魚(yú)齒樣品梳，避免拉傷凝膠頂部。

    13.  用水清洗梳子，準(zhǔn)備好在步驟16操作時(shí)重新插回樣品孔。如果用常規(guī)樣品梳，小心防止撕裂聚丙烯酰胺加樣孔，
     
    14.  凝膠電泳裝置的下層貯液槽加入1XTBE緩沖液，使凝膠夾層能浸泡在2~3 cm 的一層緩沖液中，放入凝膠夾層并用夾子固定在電泳裝置上。

    15.  上層貯槽倒入1×TBE緩沖液，使超過(guò)凝膠頂部約3 cm，用巴斯德吸管或Beral細(xì)管以1×TBE清洗凝膠頂部。
     
    16.  將清洗干凈的鯊魚(yú)齒樣品梳重新播回凝膠夾層，使其齒部?jī)H可觸及凝膠，用巴斯德吸管或Beral細(xì)管以1×TBE緩沖液*清洗加樣孔，以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。
     
    17.  加樣前，在45 V/cm 凝膠的電壓降下預(yù)電泳，使凝膠預(yù)熱，即在1 700 V，70 W 恒功率下電泳約30 min。

    18.  在加樣前，清洗加樣孔除去浸進(jìn)孔中的尿素。
     
    19.  在甲酰胺/染料溶液中的樣品，蓋好蓋子，在95℃加熱2 min，然后置于冰上，每孔加 樣2~3 μl 測(cè)序用的加樣吸頭可于每次加樣后在下槽緩沖液中沖洗2次后繼續(xù)使用。

    20.  在45~70 W 恒功率下電泳，凝膠溫度保持在約65℃。

    21.  高于此溫度可能會(huì)造成玻璃平板炸裂或條帶彌散，而太低溫度可使測(cè)序產(chǎn)物不*變性、現(xiàn)察標(biāo)志染料的遷移以確定電泳時(shí)間。

    22.  將干冰加入干膠機(jī)的冷阱并預(yù)熱至80℃。

    23.  電泳完畢時(shí)，排出上下液槽的緩沖液，并按放射性廢物處理丟棄液體。

    24.  從電泳裝置中取出凝膠夾層，并在冷自來(lái)水下沖洗直至兩面玻璃平板表面都冷卻為止，將夾層平放在紙巾上，四口玻璃平板（短平板）朝上，除去多余的液體及夾子、膠帶，取出一邊的墊片。

    25.  兩片玻璃平板之間插入一個(gè)長(zhǎng)金屬鏟子，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)鏟于將玻璃 平板橇起使之分開(kāi)，凝膠應(yīng)貼在下面的玻璃平板，如果貼在上面的平板，則將它翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)。

    26.  從插有鏟子的一邊饅慢提起上面的平板，遂漸增加角度直至上層平板*與凝膠分離。
     
    27.  一旦平板分離后，取去另一邊的墊片及除去凝膠周?chē)嘤嗟木郾０匪槠?/div> 
    28.  如果樣品含32P或33P，固定步驟可用可不用。如果樣品含33S，直接將凝膠連同玻璃平板一起放入淺托盤(pán)中，輕輕覆蓋一層約2 cm 的5%乙酸 / 5%甲醇固定液，浸泡10~15 min，不時(shí)輕輕搖動(dòng)托盤(pán)使凝膠與玻璃平板松開(kāi)。
     
    29.  將疑膠重新置于平板上，靠吸力或重力除去固定液注意保持凝膠處于平極的中央， 小心從托盤(pán)中將平板連同凝膠取出，放在工作平臺(tái)上。

    30.  將兩張干的轉(zhuǎn)印紙，疊齊如 同一張一祥，從凝膠的一端開(kāi)始緩慢地向另一端放下，貼在凝膠的表面，小心防止在紙和凝膠間形成氣泡。

    31.  從平板上剝起轉(zhuǎn)印紙，凝膠應(yīng)和它一起被揭起，逐漸卷起紙，而凝膠就同它一起被剝離平板。

    32.  將濾紙和凝膠放在預(yù)熱的干膠機(jī)中，上面覆蓋一張保鮮瞑，80℃處理20 min ~1 h，使凝膠*干燥。
     
    33.  從干膠上揭去保鮮膜，將干膠放在X光曝光盒中，Kodak XAR-5X光膠片直接與凝膠接觸，室溫放射自顯影，經(jīng)足夠時(shí)間曝光后（一般需過(guò)夜）取出X光膠片并沖印。


    常見(jiàn)問(wèn)題

    變性聚丙烯酰胺凝膠中相對(duì)于示蹤染料的寡核苷酸的遷移

    變性聚丙烯酰胺凝膠中相對(duì)于示蹤染料的寡核苷酸的遷移


    同實(shí)驗(yàn)其他方法

    電解質(zhì)梯度測(cè)序膠

    1.  按基本方案步驟1~22灌制凝膠及進(jìn)行預(yù)電泳，但上槽緩沖液為0.5×TBE，下槽為1×TBE。 2.  按基本方案步驟23~26步準(zhǔn)備樣品及加樣。   3.

    含甲酰胺的測(cè)序膠

    1.  按基本方案步驟1~5組裝凝膠平板夾層。   2.  按所需濃度配制甲酰胺凝膠溶液，加熱輕輕挽拌使之溶解，冷卻至30℃以下。 3.  加入0.15 ml TEMED

    緩沖液梯度測(cè)序膠

    1.  按基本方案步驟1~5組裝凝膠平板夾層。   2.  在2個(gè)100 ml 燒杯中，配制緩沖液梯度凝膠溶液：50 ml 用0.5×TBE配制，25 ml 用2.5×TBE配制

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