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    THP-1細(xì)胞培養(yǎng)秘籍給有需要的您

    發(fā)布時(shí)間： 2021-12-02　　點(diǎn)擊次數(shù)： 3114次

    THP-1細(xì)胞系是1980年Tsuchiya等人建立的人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系。它來(lái)自一位急性單核細(xì)胞白血病患者的血液，有分化為多種巨噬細(xì)胞的能力，是各領(lǐng)域研究常用的細(xì)胞系之一。                    



    THP-1細(xì)胞基本信息


    細(xì)胞名稱

    THP-1 (人單核細(xì)胞白血病)

    細(xì)胞別稱

    THP1; THP 1; THPI; THP-1; 

    Tohoku Hospital Pediatrics-1

    種屬

    人

    組織來(lái)源

    急性單核細(xì)胞白血病，單核細(xì)胞

    生長(zhǎng)特性

    懸浮細(xì)胞

    細(xì)胞形態(tài)

    單核細(xì)胞

    生長(zhǎng)培養(yǎng)基

    RPMI-1640＋10% FBS＋0.05mM β-mercaptoethanol＋1% P/S

    培養(yǎng)環(huán)境

    氣相：95%空氣；5%CO2

    溫度：37℃

    推薦傳代比例

    1：2-1：4

    凍存液配方

    90%FBS+10%DMSO


    THP-1細(xì)胞的特點(diǎn)


    ▲

    喜歡酸性環(huán)境

    在偏酸性環(huán)境中，THP-1生長(zhǎng)更快，所以當(dāng)培養(yǎng)基稍微變黃（呈橘紅色）時(shí)，是適合細(xì)胞生長(zhǎng)的，此時(shí)補(bǔ)液或半換液即可。（詳細(xì)操作見(jiàn)下文換液篇）


    ▲

    有密度依賴性

    THP-1細(xì)胞密度低時(shí)，生長(zhǎng)較慢，培養(yǎng)密度維持在50萬(wàn)-100萬(wàn)細(xì)胞/毫升為宜；超過(guò)200萬(wàn)/毫升則需要傳代。


    ▲

    對(duì)血清要求高

    選擇品質(zhì)好的血清更有利于THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)。


    圖片

    ▲ THP-1生長(zhǎng)圖片


    培養(yǎng)攻略之收貨篇


    常溫細(xì)胞


    收到細(xì)胞后，放進(jìn)培養(yǎng)箱靜置2-4小時(shí)，之后將瓶中培養(yǎng)基全部離心（1200rpm或250g，3分鐘），去上清，用適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按比例接種到新培養(yǎng)瓶中。


    凍存細(xì)胞


    收到細(xì)胞后，如果不復(fù)蘇，放進(jìn)-80℃冰箱暫存或放進(jìn)液氮長(zhǎng)期保存。如果復(fù)蘇，按照常規(guī)復(fù)蘇步驟操作（見(jiàn)下文復(fù)蘇篇）即可。


    小貼士：由于THP-1有密度依賴，將培養(yǎng)瓶豎著放進(jìn)培養(yǎng)箱（瓶蓋朝上），可以增加細(xì)胞局部密度，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，注意瓶蓋要保持透氣。


    圖片

    ▲ 常溫THP-1細(xì)胞，收貨處理示意圖


    培養(yǎng)攻略之換液篇


    補(bǔ)液法


    培養(yǎng)基變黃時(shí)可補(bǔ)加適量（1~2mL）新鮮培養(yǎng)基，補(bǔ)加1-2次之后，用離心的方式全部換液，離心1200rpm （約250g）3分鐘。


    半換液法


    以T25瓶子為例，瓶子里裝有5mL培養(yǎng)基。豎起瓶子靜置一段時(shí)間，待細(xì)胞沉底，小心吸出2.5mL的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到離心管，離心1200rpm （約250g）3分鐘，檢查有沒(méi)有沉淀，以免損失細(xì)胞；原瓶補(bǔ)充2.5mL新鮮培養(yǎng)基，離心管里若有細(xì)胞，則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶。


    小貼士：如果換液后第二天培養(yǎng)基就變得很黃，同時(shí)鏡下檢查未污染，說(shuō)明細(xì)胞密度大，該傳代了。


    圖片

    ▲ 半換液操作示意圖


    培養(yǎng)攻略之傳代篇


    直接分瓶法


    搖晃培養(yǎng)瓶，把細(xì)胞搖勻，均分到兩個(gè)瓶子里，每瓶再補(bǔ)充等量培養(yǎng)基。


    離心法


    離心后計(jì)數(shù)，按照40-50萬(wàn)細(xì)胞/mL的密度接種到T25瓶里，瓶中培養(yǎng)基量以5mL為宜。不方便計(jì)數(shù)時(shí)，按1:2比例傳代。


    小貼士：細(xì)胞碎片較多的情況下，建議用離心法傳代，離心轉(zhuǎn)速可適當(dāng)降低（推薦800~1000rpm或160~200g）。


    圖片

    ▲ 傳代時(shí)機(jī)


    培養(yǎng)攻略之凍存篇


    圖片

    凍存步驟


    1. 預(yù)先配制好凍存液

    2. 細(xì)胞1200rpm（約250g）3分鐘離心后

    3. 去上清，用配好的凍存液重懸細(xì)胞

    4. 轉(zhuǎn)移入凍存管

    5. 凍存管放進(jìn)程序凍存盒

    6. 凍存盒放進(jìn)-80度冰箱過(guò)夜，再放液氮長(zhǎng)期保存


    小貼士：

    1. 由于THP-1是懸浮細(xì)胞，更易受到凍存影響，建議加大凍存密度，大約200萬(wàn)-300萬(wàn)/mL為宜，以提高復(fù)蘇存活率。

    2. 沒(méi)有程序降溫盒的同學(xué)，可以選擇非程序凍存液（使用前咨詢?cè)噭┥淌欠襁m用于THP-1，并做凍存測(cè)試），或者按照【4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃ 過(guò)夜→液氮保存】的順序手動(dòng)梯度降溫。


    培養(yǎng)攻略之復(fù)蘇篇


    圖片

    復(fù)蘇步驟


    1. 預(yù)熱水浴鍋至37℃

    2. 準(zhǔn)備一個(gè)15mL離心管，加入2-3mL左右*培養(yǎng)基待用

    3. 將細(xì)胞從-80℃冰箱或液氮中取出后，放進(jìn)一次性PE手套中，立即投入水浴鍋，迅速用力搖晃管子，使其1分鐘內(nèi)融化

    4. 酒精擦拭凍存管，進(jìn)入生物安全柜，把融化的細(xì)胞懸液緩慢滴加到步驟2準(zhǔn)備好的離心管中

    5. 1200rpm（約250g）離心3分鐘

    6. 同時(shí)準(zhǔn)備1個(gè)新的T25培養(yǎng)瓶，加入5mL*培養(yǎng)基

    7. 去上清，新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后滴加到步驟6培養(yǎng)瓶里，放入培養(yǎng)箱


    小貼士：THP-1細(xì)胞復(fù)蘇后通常需要3-5天恢復(fù)狀態(tài)，建議復(fù)蘇后48小時(shí)內(nèi)不要進(jìn)行操作。


    常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案


    N.1

    收貨時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)偽足，或是碎片較多怎么辦？

    受到運(yùn)輸影響，懸浮細(xì)胞會(huì)短暫性出現(xiàn)形態(tài)改變的現(xiàn)象，如偽足等。通過(guò)傳代培養(yǎng)，1周左右可以恢復(fù)正常。一些細(xì)胞在運(yùn)輸途中死亡而產(chǎn)生碎片，通過(guò)傳代離心可以去除（見(jiàn)上文傳代篇）。


    NO.2

    培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞發(fā)生貼壁怎么辦？

    少量細(xì)胞貼壁屬于正常情況，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新瓶中即可。當(dāng)貼壁細(xì)胞的比例高于20%，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境有異常，需排查培養(yǎng)箱設(shè)置、培養(yǎng)基成分，以及培養(yǎng)器皿是否異常。


    NO.3

    培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞發(fā)生聚團(tuán)怎么辦？

    少量細(xì)胞聚團(tuán)，呈葡萄串狀，屬于正?，F(xiàn)象，特別是細(xì)胞密度較低時(shí)，易出現(xiàn)這種情況。更換血清品牌或增大血清比例（不超過(guò)20%）有助于解決聚團(tuán)問(wèn)題。不建議將聚團(tuán)的細(xì)胞吹散，等待密度高時(shí)，會(huì)自己分散開(kāi)。


    NO.4

    培養(yǎng)基里一定要加β-巰基乙醇嗎？

    β-巰基乙醇是一種常用的培養(yǎng)補(bǔ)充劑，有抗氧化的作用，可減少氧化應(yīng)激對(duì)THP-1細(xì)胞的影響。當(dāng)細(xì)胞密度過(guò)大但需要維持時(shí)，可適當(dāng)增加巰基乙醇的比例（不超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)量的1.5倍）。


    NO.5

    鏡下觀察時(shí)，難以聚焦或估算密度怎么辦？

    懸浮細(xì)胞會(huì)隨著液體流動(dòng)，不容易聚焦，靜置5-10分鐘使細(xì)胞沉底，之后再輕輕放上顯微鏡觀察，將有助于聚焦和估算細(xì)胞密度。


    圖片

    ▲ 嚴(yán)重聚團(tuán)的THP-1細(xì)胞



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