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    初代細(xì)胞培養(yǎng)——消化培養(yǎng)法

    發(fā)布時(shí)間： 2021-11-08　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1339次
    材料與儀器

    組織
    Hanks 培養(yǎng)液 胰蛋白酶
    吸管 平皿 培養(yǎng)瓶 燒杯 攪拌器 三角燒瓶 不銹鋼篩 眼科剪 眼科鑷 計(jì)數(shù)板

    實(shí)驗(yàn)步驟

    1.  準(zhǔn)備

    取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面，紫外線(xiàn)消毒20 分鐘；


    2.  布局

    點(diǎn)燃酒精燈（或煤氣燈），安裝吸管帽（應(yīng)通過(guò)火焰）；

    3.  處理組織

    把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2~3 次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘；

    4.  剪切

    用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊（用手術(shù)刀割亦可），以便于消化；加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞；

    5.  消化

    或用恒溫水浴，或置入37 ℃溫箱消化均可，消化中每隔20 分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨茫ㄏ捌恐行柚靡粺o(wú)菌攪棒）；消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定；

    6.  分離

    在消化過(guò)程中見(jiàn)消化液發(fā)混濁時(shí)，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過(guò)適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開(kāi)的組織塊（必要時(shí)可繼續(xù)進(jìn)行消化）；低速（500~1000 轉(zhuǎn)/分）離心消化液5 分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液（如有其它酶或EDTA 等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再加入培養(yǎng)液）；

    7.  計(jì)數(shù)

    用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過(guò)大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中；對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，pH 要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說(shuō)膽液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整；

    8.  培養(yǎng)

    置入36.5 ℃溫箱培養(yǎng)；如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽（松口）堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時(shí)需更換新塞。



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