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    細(xì)胞培養(yǎng)之“麻煩精”支原體的防治方法

    發(fā)布時間: 2021-09-28  點擊次數(shù): 1187次

    支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染,。因支原體屬于直徑介于0.2-2µm的最小原核生物,形態(tài)易變,所以即使用濾網(wǎng)給培養(yǎng)基過濾20次,它還會在已經(jīng)感染的培養(yǎng)基中“陰魂不散",而又因為它缺少細(xì)胞壁,沒有這層外衣包裹之后的它,可以成功逃過大部分抗生素的“追殺"。在細(xì)胞培養(yǎng)液中,支原體可達(dá)到107-108CFU/mL(CFU=Colony Forming Unit,是一種支原體的濃度測量單位)而不使培養(yǎng)液混濁及影響細(xì)胞生長,而因為在初感染時它不會給細(xì)胞帶來任何影響,這一點,估計黑膠蟲都要被它隱蔽得方式折服。


    那么支原體污染對細(xì)胞有什么影響呢?

    1.支原體污染導(dǎo)致細(xì)胞收縮,貼壁細(xì)胞脫落裂解,細(xì)胞空泡化。。。

    2.引起細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、rRNA、mRNA 的合成障礙;

    3.使培養(yǎng)基成分發(fā)生改變(如發(fā)酵型支原體降解糖類產(chǎn)生酸性物質(zhì)),影響細(xì)胞代謝

    4.破壞細(xì)胞膜的完整性,影響細(xì)胞信號傳遞;

    5.引起細(xì)胞的染色體異常;

    6.使惡性細(xì)胞致癌能力下降、影響淋巴細(xì)胞分化以及細(xì)胞中病毒的產(chǎn)量。


    支原體污染有哪些檢測方法?

    1.相差顯微鏡檢測;

    2.低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察;

    3.DNA熒光染色法;

    4.電鏡檢測;

    5.3-H胸腺嘧啶摻入法;

    6.聚合酶鏈反映法;

    7.免疫學(xué)方法;

    8.支原體的培養(yǎng)。


    支原體污染的補救的方法:

    1.抗生素排除法:可以用5-10倍于常用量的沖擊法,加入高濃度抗生素后作用24-48小時,再換入常規(guī)培養(yǎng)液,有時可能有效。推薦用量:慶大霉素 200ug/ml ,四環(huán)素10ug/ml ,卡那霉素50ug/ml 。對于支原體污染抗生素應(yīng)用,預(yù)防性應(yīng)用比污染后使用好。

    2 . 加溫除菌:根據(jù)支原體耐熱性能差的特點。將受支原體污染的細(xì)胞置于41度中作用5-10小時可以殺滅支原體。但由于41度對培養(yǎng)細(xì)胞本身也有較大的影響,故處理前,應(yīng)*行預(yù)試驗,確定出最大限度殺傷支原體而對細(xì)胞影響較小的處理時間。

    3.裸鼠過繼法:將支原體污染的細(xì)胞用0,25%胰酶,0.02%EDTA消化制成單細(xì)胞懸液后用PBS洗滌離心2次,調(diào)細(xì)胞密度至10^7 /ml;經(jīng)小鼠背部皮下接種0.2ml細(xì)胞約10~15天后即可形成移植瘤;3~4周后無菌條件下取出移植瘤組織,剔除壞死部分,用注射器針芯在200目篩下將組織壓碎使細(xì)胞釋放入含0.1%EDTA的無血清DMEM培養(yǎng)液中:將細(xì)胞懸液小心加入含有淋巴細(xì)胞分離液離心管上層,室溫下水平離心 3000r/min,20min;用吸管吸出兩種液體界面層的細(xì)胞,置無血清DMEM培養(yǎng)液中,再用無血清DMEM將細(xì)胞洗滌離心1次,用*培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度至5×105個/ml,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。



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