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    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    發(fā)布時間： 2021-09-16　　點擊次數(shù)： 3214次

    在分子生物學中，未知基因全長序列的獲取是研究新基因的重要步驟。當我們不清楚目的基因的完整序列時，獲得未知序列的方法有反向PCR、mRNA差異顯示技術(shù)、基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫篩選技術(shù)等等......


    背景介紹

    今天我們來一起了解一種可從低豐度轉(zhuǎn)錄本中獲得cDNA末端序列的方法—RACE技術(shù)。當我們不清楚目的基因的完整序列，只知道其中的一段序列時，就可以通過RACE技術(shù)獲得mRNA兩端序列，再與已知序列拼接，從而得到完整mRNA序列。相比其他獲得mRNA全長的技術(shù)，RACE具有簡單、快速、廉價的優(yōu)勢，因而得到較多的運用。


    RACE是什么？

    RACE全稱為rapid amplification of cDNA end，即cDNA末端快速擴增技術(shù)，就是已知部分cDNA序列，基于mRNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)獲得完整的cDNA的 3'或5'末端的分子生物學技術(shù)。


    RACE可以應(yīng)用在哪些實驗方向？

    構(gòu)建cDNA文庫

    lncRNA全長克隆

    獲得抗體可變區(qū)序列

    miRNA靶基因序列驗證

    已知基因一段序列，克隆旁側(cè)序列

    獲得病毒基因組

    ......

    總體來說，就是用來測定cDNA序列，獲得RNA全長序列。


    RACE技術(shù)類型及特點？

    RACE技術(shù)有多種類型，根據(jù)各個RACE技術(shù)原理的不同，適合于不同的RNA，快來跟著小編一起來了解下吧~

    經(jīng)典RACE

    經(jīng)典RACE技術(shù)是在1988年由Frohman等[1]發(fā)明。經(jīng)典RACE技術(shù)包括5'RACE和3'RACE，分別克隆cDNA的5'端和3'端。


    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    1. 3'RACE利用真核生物mRNA 3'端具有poly A結(jié)構(gòu)的特點，使用5'端帶有接頭序列的oligo dT與之結(jié)合進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA；

    2. 再利用根據(jù)已知序列設(shè)計的上游引物和與接頭序列互補配對的下游引物進行PCR擴增，得到cDNA 3'末端擴增產(chǎn)物。

    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    1. 經(jīng)典RACE技術(shù)中的5'RACE是利用根據(jù)已知序列設(shè)計的下游引物GSP作為逆轉(zhuǎn)錄引物，合成一鏈cDNA；

    2. 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在新合成的cDNA 3'末端加上poly A；

    3. 帶有接頭序列的Oligo dT引物與一鏈cDNA 3'末端的poly A結(jié)合，合成二鏈cDNA；

    4. 再以第二鏈cDNA為模板，利用GSP和接頭引物作為上下游引物進行PCR擴增，得到cDNA 5'末端擴增產(chǎn)物；

    得到的5'末端產(chǎn)物和3’末端產(chǎn)物可以通過克隆連接到適當?shù)妮d體上，進行測序獲得末端序列。將測序得到的cDNA末端序列，與已知的中間序列進行拼接，就可獲得cDNA全長序列。


    經(jīng)過科學技術(shù)的發(fā)展，由經(jīng)典RACE又衍生出多種RACE技術(shù)，增加了RACE技術(shù)的適用廣泛性，我們再來一起了解下其他的RACE技術(shù)吧！

    Cap-switching RACE

    Cap-switching RACE針對mRNA發(fā)生斷裂的可能，進行了技術(shù)優(yōu)化[2-4]。


    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    1. Cap-switching RACE是以O(shè)ligo dT作為逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄獲得一鏈cDNA；

    2. 當逆轉(zhuǎn)錄到mRNA的5'帽子結(jié)構(gòu)時，莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（MMLV）會在新合成的cDNA的3'末端加上若干個胞嘧啶；

    3. 接著，使用5'端帶有接頭、3'端帶有poly G結(jié)構(gòu)的接頭引物與cDNA 3'端的poly C互補配對，逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)以接頭為模板合成cDNA，完成接頭轉(zhuǎn)化，新合成的一鏈cDNA 3'端就含有一段接頭序列；

    4. 然后再利用接頭引物進行PCR獲得RACE產(chǎn)物。

    RLM-RACE

    RLM-RACE技術(shù)的出現(xiàn)同樣也是為了擴增到完整mRNA的5'末端，避免mRNA斷裂帶來的影響。


    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    1. 首先在RNA體系中加入牛小腸堿性磷酸酶（CAP），特異性地識別并切除斷裂mRNA 5'端暴露的磷酸基團；

    2. 再向體系中加入煙草酸焦磷酸酶（TAP），切除mRNA 5'端完整的帽子結(jié)構(gòu)，使mRNA 5'端暴露出一個磷酸基團；

    3. 接著加入RNA連接酶將接頭與mRNA 5'端暴露的磷酸基團連接，而切除了磷酸基團的斷裂RNA則不能與接頭結(jié)合，這樣便獲得了5'端帶有接頭的完整mRNA；

    4. 最后再進行RT-PCR。

    Adapter-Ligated RACE

    Adapter-Ligated RACE技術(shù)同樣是為了獲得更長的mRNA序列，但相對來說不一定能獲得全長mRNA序列[5]。


    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    1. 向逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA體系中加入T4連接酶，利用T4連接酶將接頭連接到cDNA兩個末端上；

    2. 短cDNA的退火溫度低，兩端接頭容易發(fā)生退火，形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)；

    3. 長的cDNA退火溫度高，不易形成鍋柄裝結(jié)構(gòu)，因此引物可以與接頭結(jié)合，進行PCR擴增。


    環(huán)形-RACE

    環(huán)形-RACE使用一對基因特異性引物進行擴增，提高了PCR擴增的特異性[6]。

    1. 環(huán)形RACE是利用T4連接酶將cDNA的末端連接，形成cDNA的環(huán)化結(jié)構(gòu)或串聯(lián)結(jié)構(gòu)；

    2. 根據(jù)mRNA上的已知區(qū)域設(shè)計特異性引物GSP，以GSP引物合成第二條cDNA鏈；

    3. 在未知序列兩端根據(jù)已知序列設(shè)計一對GSP進行PCR擴增，將未知序列置換到已知序列中間位置，得到中間是未知序列、兩端是已知序列的擴增產(chǎn)物。



    RCA-RACE

    RCA-RACE (rolling circle amplification rapid amplification of cDNA ends)類似于環(huán)形RACE，但是RCA-RACE在環(huán)化的過程中并不會產(chǎn)生串聯(lián)結(jié)構(gòu)，PCR擴增過程中所使用的引物既可以是特異性引物，也可以是隨機引物。PCR擴增使用φ29聚合酶，這種酶的特點是會把酶前行方向上的前鏈從原來的模板鏈上進行解鏈、移開。RCA-RACE利用這種特點，可以讓模板上的每個點在第一輪反應(yīng)中，都有機會得到n個拷貝，產(chǎn)物呈指數(shù)擴增。

    RCA-RACE利用ATP依賴性的熱穩(wěn)定連接酶，將一條cDNA末端的5'磷酸基團和3'羥基連接，形成單分子環(huán)狀DNA。再使用隨機引物或基因特異性引物，在φ29 DNA聚合酶的催化下進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物呈指數(shù)增長。


    RACE的技術(shù)特點對比

    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    基于RACE技術(shù)原理，以下幾點可提高RACE實驗的成功率：

    1. 保證RNA模板的完整性。實驗之前最好進行瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性。

    2. 使用高特異性引物。如使用Vazyme的RACE引物設(shè)計軟件，軟件會給出多條合適的RACE引物，可選擇多條基因特異性引物進行RACE實驗，提高成功率。


    3.巢式PCR。應(yīng)用巢式PCR設(shè)計引物時，在引物中加入特異性序列和適當?shù)拿盖形稽c，一方面可以增加對目的片段的特異性克隆，另一方面也方便后續(xù)的測序和實驗


    安培可以提供

    HiScript-TS 5'/3' RACE Kit（Vazyme #RA101）基于Cap-switching RACE原理開發(fā)，試劑盒中包括5'RACE和3'RACE的所有組分，可分別獲得5'RACE和3'RACE的產(chǎn)物。

    原理圖如下：


    盤點RACE技術(shù)的幾種類型及特點

    成功率高：經(jīng)測試RA101陽性率可達到70 %以上

    操作流程簡便、體驗感優(yōu)：步驟簡化，一管內(nèi)完成模板轉(zhuǎn)換和一鏈cDNA合成；組分Mix形式，減少加樣步驟、降低加樣所帶來的污染

    配套RACE引物設(shè)計軟件和序列比對軟件：包含RACE實驗引物設(shè)計軟件和序列比對軟件，以及使用說明文件，簡化RACE實驗設(shè)計環(huán)節(jié)


    【參考文獻】

    [1] Frohman M A，Dush M K，Martin G R． Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide prime［J］． Proc． Nat． Acad． Sci． USA，1988，85( 23) : 8998 － 9002．

    [2] Matz M，Shagin D，Bogdanova E，et al． ． Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR［J］． Nucl． Acid Res． ，1999，27( 6) : 1558 － 1560．

    [3] Schramm G，Bruchhaus I，Roeder T． A simple and reliable 5- RACE approach［J］． Nucl． Acid Res． ，2000，28( 22) : e96．

    [4] Schmidt W M，Mueller M W． CapSelect: a highly sensitive method for 5'CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs［J］． Nucl． Acid Res． ， 1999，27( 21) : e31．

    [5] Chenchik A，Diachenko L，Moqadam F，et al． ． Full-length cDNA cloning and determination of mRNA 5' and 3' ends by amplification of adaptor-ligated cDNA［J］． Biotechniques， 1996，21( 3) : 526 － 535．

    [6] Maruyama I N，Rakow T L，Maruyama H I． cRACE: a simple method for identification of the 5' end of mRNAs［J］． Nucl． Acid Res． ，1995，23( 18) : 3796 － 3797．

    [7] 徐燁, 劉雅婷, 代文瓊,等. 幾種主要的RACE技術(shù)及應(yīng)用 [J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報, 2012, 014(002):81-87.



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