A君：我要表達一個 ras 加 GFP 融合蛋白，怎么設(shè)計引物？

安培君：你的 GFP 標簽蛋白在載體里還是要你自己插進去？

A君：是我自己插進去。

安培君：你打算怎樣融合？

A君：是不是這樣？酶切 A 基因，酶切質(zhì)粒，把 A 先插入載體，篩選出克隆，然后酶切 B 基因，用不同的酶酶切質(zhì)粒，將 B 基因插入含 A 的載體。

安培君：No,何必這么復雜，SOE PCR 吧！

A君：什么是 SOE PCR？

SOE PCR 是一種通過寡聚合甘酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板進行 PCR 擴增，從而獲得目的 DNA 基因片段的方法。SOE PCR 可簡單地憑借互補引物，通過 PCR 迅速地將兩段 基因連接在一起，成為新的雜交基因片段。

若要將基因 A 和 B 連接在一起，假設(shè)引物 P1、P2 擴增基因片段 A，引物 P3、P4 擴增基因片段 B；P2、P3 為內(nèi)引物，P2 上含有 B 的序列，P3 上含有 A 片段的互補序列。單獨 PCR 后， P1、P2 將 A 的 3'端帶有 B 的 5'端的互補序列，P3、P4 將 B 的 5'端帶有 B 的 3'端的互補序列；將各自 PCR 產(chǎn)物混合作為模板，變性退火后，A 鏈和 B 鏈結(jié)合起來，延伸成新的雜交基因，可以將 A、B 連接起來。

下面以表達融合蛋白 S 和 A 為例，給大家介紹拼接基因 S 和基因 A 的方法,先在 NCBI 中 查找兩個基因的 mRNA 序列，然后利用 primer6.0 軟件，設(shè)計擴增基因 S 和 A 基因的引物， 并去除 S 的終止子和 A 基因的起始密碼。

關(guān)鍵問題來了，引物要怎么設(shè)計？SOE PCR 引物設(shè)計跟普通 PCR 引物有什么不同？ 

*SOE PCR 引物比較長，可長達 80bp，太短要增加反應次數(shù)，提高成本。（土豪可忽略） 

*引物有重疊區(qū)域，引物間的 overlap region 以 25~30bp 為宜，盡量避免富含 AT 的序列。 

*考慮引物的 TM 值，依照“50℃規(guī)則“可以設(shè)計出可行的重疊區(qū)，但也必須全面考慮其他引物的 Tm 值，在 PCR 的前 5 個循環(huán)中，采用就低引物 Tm 值設(shè)計退火溫度是很好的解決辦法。 

*引物長，更要避免自身二級結(jié)構(gòu)、引物二聚體形成等。 在 S 上游引物 5'端加入 EcoR V 限制性核酸內(nèi)切酶位點，在其下游引物 5'端則加入 BamH I 限制性核酸內(nèi)切酶位點、含 5 個氨基酸殘基的柔性肽基因序列(linker 序列) 以及基因 A 的部分 5'端序列，在 A 基因的上游引物 5 端加入 BamH I、含 5 個氨基酸殘基的柔性肽基因序列 (linker 序列)以及基因 S 的部分 3’端序列，在其下游則加入酶切位點 Not I 酶切位點。

S (P1): 5'-ATAGATATC GGAGAA CGG GAT ATG TTT AG-3' 

S (P2)5'- ATA GGATCC ACC GCC ACC GAC ATTGCC AAC GTA TTT TAAG- 3' 

A (P3): 5'-ATA GGA TCC GGT GGC GGT GGC TCC GCT CAA GTA AT C AAC ACT-3' 

A (P4): 5'-GCGGCCGC CGACAT CCTATC GACCTAAC-3'

劃線部分為酶切位點 

接著以 S (P1)和 S (P2)為引物，含有 S 基因的 cDNA 為模板；以 A (P3)和 A (P4)為引物，含有 A 基因的 cDNA 為模板；進行 PCR,得到上述產(chǎn)物并鑒定后，將兩者混合作為模板，以 S (P1)  和 A (P4)為引物擴增融合基因 S-A。采用兩步法循環(huán)模式：第一步將兩種模板混合后，在不加引物的情況下循環(huán) 3 次；第二步加上引物后，在循環(huán) 28 次。

將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入載體進行后續(xù)的克隆。 引物的結(jié)構(gòu)組成看上去雖然復雜，但設(shè)計起來卻十分簡單，無非就是在普通引物設(shè)計的基礎(chǔ)上加上重疊區(qū)以及一些修飾： 

*Gene S 5’端的修飾，gene A 3 ‘端的修飾，比如增加限制性酶切位點進行克隆和表達。 

*Gene S 3’端的突變，gene A 5’端的突變，比如進行偏嗜密碼子的修改、起始密碼子的摻入。 

*在 gene S 和 gene A 之間添加 DNA linker。

在應用這一技術(shù)時，還有幾個要注意的問題： 

*DNA 酶的質(zhì)量：應避免使用 Taq 酶，因其在 PCR 產(chǎn)物 3 端添加一個突出的 A，從而造成移碼，翻譯蛋白時全部錯位，不好意思今天白忙活，去墻角哭會。因此，為了最大限度地避免堿基的錯配，一般采用具有 3‘-5‘外切酶活性的高保真酶，如 TLI DNA Polymerase (Promege)、 KOD DNA Polymerase（Toyobo）、Pyrobest DNA Polymerase (Takara)。比起普通酶，這些高保真酶是貴了點，但真的物有所值。 

*模板的來源： 在構(gòu)建嵌合 ORF 時，如果選擇基因組 DNA 為模板的話，可能會 P 出非翻譯 區(qū)，宜選擇 mRNA 作為原始模板。

*接頭序列(Linker)：通過一段適當?shù)暮塑账嵝蛄袑⒉煌哪康幕蜻B接起來, 使其在適當?shù)纳矬w內(nèi)表達成為一條單一的肽鏈, 使得融合蛋白中的兩種成分能分別形成正確的空間結(jié)構(gòu)、 更好的發(fā)揮生物學活性。Linker 序列就像安排一個人畜無害的小伙伴在性格比較暴躁的兩人之間，充當和平使者，避免沖突。 

*Mg2+是 DNA 聚合酶活性的依賴離子，Mg2+濃度過低會影響聚合酶活性，過高會造成非特異擴增。SOE-PCR 中：在保證產(chǎn)物擴增效率及特異性的前提下，盡可能降低 Mg2+的濃度， 這可最大限度地提高 DNA 聚合酶的保真性。

今天就分享到這，大家記得要好好消化一下！