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瓊脂糖凝膠電泳、酶和試劑的使用等一些注意事項
發(fā)布時間: 2021-08-24 點擊次數(shù): 1533次基因克隆在發(fā)明后的 32 年,需求一直不斷增加,但是有些小伙伴的重組質(zhì)粒就是怎么樣都構(gòu)建不出來。其實,看似簡單的傳統(tǒng)基因克隆,可是存在著重重陷阱!美國羅林斯研究中心 (Rollins Research Center)Ichiro Matsumura 在一期的《BioTechniques》上分享了他的經(jīng)驗: “Why Johnny can’t clone: Common pitfalls and not so common solutions."小編今天就把核心的 “姿勢"給大家提煉出來,主要是瓊脂糖凝膠電泳、酶(DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 連接 酶等)和試劑的使用等一些注意事項。
▲從 PCR 產(chǎn)物到質(zhì)粒的工作流程
1.聚合酶
DNA 聚合酶有兩個對 PCR 過程不可少的附加屬性,但是不利于后續(xù)克隆的步驟。第一, Taq/DNA 混合物的解離常數(shù)在室溫中是 20 nM,與擴(kuò)增產(chǎn)物的終濃度相當(dāng),因此酶往往與擴(kuò)增產(chǎn)物同時純化。實際上,大多數(shù)其他商用 DNA 聚合酶與 DNA 結(jié)合的更加緊密。殘存的聚合酶可以阻止限制性內(nèi)切酶作用于 DNA 末端,或者填補(bǔ)突出的部分。第二,市場上一些改造后的新型 DNA 聚合酶相比于 Taq 酶熱穩(wěn)定性更高,在有機(jī)溶劑和離液鹽中的構(gòu)象穩(wěn)定性也更高,PCR 產(chǎn)物的純化更加困難了。
2.割膠回收
載體經(jīng)過酶切后,需要經(jīng)過凝膠純化提高克隆效率。割膠回收對技術(shù)要求高,也很難自動化, 而且 DNA 暴露在紫外光下會大大降低轉(zhuǎn)化效率。凝膠純化的產(chǎn)量往往有限,因此研究人員需要消化毫克級的 DNA,才能產(chǎn)生最后的終產(chǎn)物。殘留的瓊脂糖或凝膠提取過程中引入的各種溶劑和鹽,可能抑制后續(xù) T4 連接酶的活性,從而降低克隆效率。另外回收效率還與片段的長短相關(guān),小于 500bp,或者大于 4kb 的片段,加異丙醇有助于提高回收效率。
3.限制性內(nèi)切酶
限制性內(nèi)切酶的出現(xiàn)是為了保護(hù)細(xì)菌免受噬菌體及其他入侵者。因此,限制性內(nèi)切酶/DNA 底物的 KM 值相當(dāng)?shù)停资铣?shù) KM 值等于酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時的底物濃度,是酶的特征性常數(shù)之一。KM 值只與酶的結(jié)構(gòu)、酶所催化的底物和反應(yīng)環(huán)境如溫度、PH、 離子強(qiáng)度有關(guān),與酶的濃度無關(guān)。Km 值愈小,酶與底物的親和力愈大)。所以“提高酶切反 應(yīng)中 DNA 的濃度,這樣凝膠純化的產(chǎn)物才足夠連接反應(yīng)使用"是錯誤的!在這種情況下, 限制性內(nèi)切酶會受到抑制,從而導(dǎo)致不*的消化。
4.T4 連接酶
連接反應(yīng)失敗的原因有很多,但失敗可能在加入 T4 DNA 連接酶之前就發(fā)生了:由于 DNA 聚合酶擴(kuò)增不*導(dǎo)致的末端不均一、酶切不*、連接酶抑制劑或者突出的部分被補(bǔ)平。在某些情況下,連接反應(yīng)失敗可能是因為退火效率不夠、反應(yīng)緩沖液中的 ATP 濃度過低(室溫孵育時間過長)或者酶可能變性了。T4 連接酶在室溫下相當(dāng)穩(wěn)定,但如果被水而不是合適的 buffer 稀釋后可不是如此。如果有問題,可以通過陽性對照來檢測酶的完整性:
5.感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化
在克隆過程中,具有高效轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞至關(guān)重要,這對于之前并不高的分子克隆效率具有一定的補(bǔ)償作用。最常見的兩種轉(zhuǎn)化方法:熱激轉(zhuǎn)化和電穿孔。電穿孔是*的,更重要的是,轉(zhuǎn)化細(xì)胞的數(shù)量與 DNA 的量成正比,可以達(dá)到微克級別,且不會出現(xiàn)熱激中 出現(xiàn)的菌株效應(yīng)或者對質(zhì)粒的長度有限制,所以對于困難的克隆項目,電穿孔無疑是首先選擇的方法。不過雖然熱激轉(zhuǎn)化效率不及電穿孔,而且會因 DNA 過量(>10ng/200μl 感受態(tài)細(xì)胞)而抑制轉(zhuǎn)化,但是它方便??!“冰一冰、熱一熱、涼一涼、加一下再搖一搖"就搞定了,所以還是有很多人使用這個方法的!
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